今天小編就帶大家來了解一下高效液相色譜儀。我將從原理、結(jié)構(gòu)及功能、色譜特點以及應用等四個方面介紹一下高效液相色譜儀。
原理：高效液相色譜儀(HPLC)是應用高效液相色譜原理，主要用于分析高沸點不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定的和分子量大的有機化合物的儀器設備。它由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。HPLC廣泛應用于生命科學、食品科學、藥物研究以及環(huán)境研究中。儲液器中的流動相被高壓泵打入檢測系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相)內(nèi)，由于樣本溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運動時，經(jīng)過反復多次的“吸附-解吸”的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣本濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式輸出檢測結(jié)果。
根據(jù)分離機制的不同，HPLC原理可分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法。
1.液固吸附色譜法
液固吸附色譜法中，固定相為固體吸附劑，根據(jù)各組分吸附能力差異而使組分得以分離。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，大多數(shù)用于非離子型化合物。吸附色譜固定相可以分為極性和非極性兩大類。對流動相的要求為：
1)選用的溶劑應當與固定相互不相溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性。
2)選用的溶劑應有高純度，以防所含微量雜質(zhì)在柱中積累，引起柱性能的改變。
3)選用的溶劑性能應與所使用的檢測器相匹配，如果使用紫外吸收檢測器，就不能選用在檢測波長下有紫外吸收的溶劑；若使用示差折光檢測器，就不能用梯度洗脫。
4)選用的溶劑應對樣品有足夠的溶解能力，以提高測定的靈敏度。
5)選用的溶劑應具有低的黏度和適當?shù)偷姆悬c。
6)應盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑，以保證工作人員的安全。
液固色譜法是以表面吸附性能力為依據(jù)的，所以它常用于分離極性不同的化合物，也能分離那些具有相同極性基團，但數(shù)量不同的樣品。
2.液液分配色譜法：固定相為液體，根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中的溶解度不同而分離。依固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法和反相色譜法。正相色譜法采用極性固定相，流動相為相對非極性的疏水性溶劑，常用于分離中等極性和極性較強的化合物；反相色譜法一般用非極性固定相，流動相為水或緩沖溶液，適用于分離非極性和極性較弱的化合物。其中，反相色譜應用*。
3.離子交換色譜法：固定相是離子交換樹脂。樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行交換，根據(jù)各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
結(jié)構(gòu)及功能：HPLC儀一般由溶劑輸送系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)(色譜柱)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理與記錄系統(tǒng)組成，具體包括儲液器、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀或數(shù)據(jù)工作站等幾部分。其中輸液泵、色譜柱和檢測器是HPLC儀的關鍵部分。
1.溶劑輸送系統(tǒng)
儲液器：用來貯存數(shù)量足夠、符合要求的流動相。配有溶劑過濾器，以防止流動相中的顆粒進入泵內(nèi)。
脫氣器：脫氣的目的是為了防止流動相從色譜柱內(nèi)流出時釋放出氣泡進入檢測器，從而引起噪聲，不能正常檢測。
輸液泵：將儲液器中的流動相連續(xù)不斷地以高壓形式進入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。
梯度洗脫裝置：是在分離過程中通過逐漸改變流動相的組成增加洗脫能力的一種裝置。
2.進樣系統(tǒng)
進樣器：是將樣品送入色譜柱的裝置，進樣方式可以分為兩種：閥進樣或自動進樣。比較常用的是采用自動進樣器裝樣。
3.分離系統(tǒng)色譜柱：對樣品進行分離，是整個色譜系統(tǒng)的心臟，它的質(zhì)量優(yōu)劣直接影響到分離的效果。
4.檢測系統(tǒng)檢測器：將色譜柱連續(xù)流出的樣品組分轉(zhuǎn)變成易于測量的電信號，被數(shù)據(jù)系統(tǒng)接收，得到樣品分離的色譜圖。
5.數(shù)據(jù)處理和記錄系統(tǒng)對色譜數(shù)據(jù)進行處理，并參與HPLC儀器的自動控制。
色譜特點
高壓——壓力可達150～300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。
高速——流速為0.1～10.0mL/min。
高效——塔板數(shù)可達5000/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。
高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
速度快——通常分析一個樣品在15～30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。
靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。
色譜柱可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
應用
高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。
與試樣預處理技術相配合，HPLC所達到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時測定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能，能夠分離復雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。
HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復利用，流出組分易收集等優(yōu)點，因而被廣泛應用到生物化學、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機分析等各種領域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個重要的發(fā)展方向。
液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等；液相色譜-紅外光譜聯(lián)用也發(fā)展很快，如在環(huán)境污染分析測定水中的烴類，海水中的不揮發(fā)烴類，使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。
